مکانیزم فوکوس اسکنر اسلاید میکروسکوپ چیست؟

اگر تا به حال وقت خود را صرف تجزیه و تحلیل اسلایدهای آسیب شناسی دیجیتال یا تصویربرداری از نمونه های تحقیقاتی کرده اید، احتمالاً از خود پرسیده اید که چگونه اسکنر اسلاید میکروسکوپ همه جزئیات را با چنین دقتی ثبت می کند - حتی زمانی که اسلاید دارای تغییرات جزئی ارتفاع یا عیوب کوچک است که فوکوس یک دوربین استاندارد را از بین می برد. به‌عنوان تامین‌کننده اسکنرهای اسلاید دیجیتال با کارایی بالا، همیشه این سوال برای من وجود دارد و این یکی از مهم‌ترین بخش‌های این است که چرا تجهیزات ما نتایج قابل اعتماد و ثابتی را روز به روز ارائه می‌دهند. بیایید دقیقا نحوه عملکرد مکانیسم فوکوس، اهمیت این مکانیسم برای موارد مختلف و نحوه مهندسی اسکنرهای ما برای برتری در این زمینه را بررسی کنیم.

ابتدا، اجازه دهید با اصول اولیه شروع کنیم: اسلایدهای میکروسکوپ کاملاً مسطح نیستند. یک اسلاید شیشه ای استاندارد حدود 1 میلی متر ضخامت دارد، اما نمونه های بیولوژیکی (مانند برش های بافتی، کشت سلولی، یا آماده سازی سیتولوژی) روی آن نصب می شوند و ارتفاع آنها می تواند بین 10 تا 50 میکرون متفاوت باشد - گاهی اوقات بیشتر، بسته به نحوه تهیه نمونه. حتی گرد و غبار یا زباله های جزئی روی اسلاید، لایه های کوچک و غیرمنتظره ای را اضافه می کند. برای اینکه یک اسکنر بتواند یک تصویر واضح بگیرد، فوکوس آن باید به طور مداوم در حین حرکت در سراسر اسلاید تنظیم شود، و باید این کار را سریعتر از چشمک زدن یک چشم انسان انجام دهد، در حالی که دقت آن در کسری از میکرون حفظ شود. این کار کوچکی نیست.

اکثر اسکنرهای اسلاید میکروسکوپ از یکی از دو فناوری فوکوس اصلی استفاده می‌کنند: فوکوس خودکار غیرفعال (AF) یا AF فعال، و بسیاری از مدل‌های سطح بالا هر دو را ترکیب می‌کنند تا بهترین‌ها را از هر دو دنیا دریافت کنند. بیایید با فوکوس خودکار غیرفعال شروع کنیم، زیرا این همان چیزی است که در اسکنرهای روشنفیلد سطح ابتدایی خود مانند اسکنر اسلاید برایتفیلد EScan-1200 ایجاد کرده ایم. AF غیرفعال هیچ سیگنال خارجی منتشر نمی کند. در عوض، نور منعکس شده از اسلاید را تجزیه و تحلیل می کند تا مشخص کند واضح ترین فوکوس کجاست. نرم افزار سیستم به کنتراست تصویر در پنجره های کوچک نگاه می کند، زیرا اسکنر لنز را بالا و پایین می برد. وقتی کنتراست در بالاترین حد است، نقطه فوکوس واضح است. برای کاربردهای روشنایی، که در آن نمونه‌ها با رنگ‌هایی که تفاوت‌های روشن و تاریکی مشخصی ایجاد می‌کنند، رنگ‌آمیزی می‌شوند، این کار واقعاً خوب است. برای اسکن اسلایدهای فیلد روشن با بزرگنمایی 20 یا 40 برابر به اندازه کافی سریع است و برای آزمایشگاه هایی که نیازی به تصویربرداری فلورسانس ندارند هزینه ها را پایین نگه می دارد. اما فوکوس خودکار غیرفعال محدودیت‌های خود را دارد—اگر یک اسلاید دارای یک ناحیه بسیار یکنواخت و با کنتراست پایین باشد (مانند لبه شیشه‌ای شفاف یا یک نمونه نازک و بدون رنگ)، نرم‌افزار نمی‌تواند تفاوت‌های کنتراست را تشخیص دهد و ممکن است فوکوس تغییر کند.

اینجاست که فوکوس خودکار فعال وارد می‌شود، و این فناوری است که ما برای اسکنرهای درجه تحقیقاتی، مانند اسکنر اسلاید فلورسانس درجه تحقیقاتی، اولویت داریم. AF فعال از یک حسگر یا منبع نور جداگانه برای پخش سیگنال روی اسلاید استفاده می‌کند، سپس نحوه بازتاب آن سیگنال را اندازه‌گیری می‌کند تا فاصله دقیق لنز تا نمونه را محاسبه کند. دو نوع متداول AF فعال مورد استفاده در اسکنرهای اسلاید، مثلث‌سازی لیزری و فوکوس مبتنی بر انحرافات رنگی هستند. مثلث‌سازی لیزر ساده‌تر است: یک پرتو لیزر مادون قرمز کم‌مصرف به سمت اسلاید نشان داده می‌شود و یک حسگر دوربین تشخیص می‌دهد که نقطه لیزر روی اسلاید کجا قرار می‌گیرد. اگر اسلاید خیلی نزدیک یا خیلی دور باشد، نقطه روی حسگر حرکت می‌کند و اسکنر موقعیت لنز را تنظیم می‌کند تا نقطه را به نقطه ایده‌آل بازگرداند. این حتی بر روی نمونه‌های با کنتراست کم نیز کار می‌کند، زیرا فاصله فیزیکی را اندازه‌گیری می‌کند، نه کنتراست نور را. فوکوس انحراف رنگی از منبع نوری استفاده می کند که به طول موج های رنگی مختلف تقسیم می شود. هر طول موج در فاصله کمی متفاوت فوکوس می کند، بنابراین اسکنر نحوه انعکاس هر رنگ را از اسلاید مقایسه می کند تا فوکوس را محاسبه کند. این به ویژه برای اسلایدهای فلورسانس مفید است، که می توانند حتی کنتراست کمتری نسبت به نمونه های میدان روشن داشته باشند، زیرا فلوروفورها به جای بازتابش، نور را ساطع می کنند.

بسیاری از اسکنرهای ما، مانند اسکنر اسلاید آسیب شناسی دیجیتال، از یک سیستم AF ترکیبی استفاده می کنند که فوکوس خودکار غیرفعال و فعال را برای از بین بردن نقاط کور ترکیب می کند. نحوه کار به این صورت است: هنگامی که اسکنر برای اولین بار یک اسلاید را بارگیری می کند، از فوکوس خودکار فعال برای ترسیم نمایه ارتفاع کل اسلاید در 10 ثانیه اول استفاده می کند. این یک "نقشه توپوگرافی" از اسلاید ایجاد می کند که هر برآمدگی، شیب و تغییر را علامت گذاری می کند. سپس، همانطور که اسکنر در سراسر تصاویر ثبت اسلاید حرکت می کند، از فوکوس خودکار غیرفعال برای تنظیم سریع فوکوس برای هر میدان دید فردی استفاده می کند، و تنها زمانی که با مناطقی مواجه می شود که AF غیرفعال با مشکل مواجه می شود، از نقشه از پیش بارگذاری شده استفاده می کند. این رویکرد ترکیبی زمان اسکن را کاهش می‌دهد و در عین حال اطمینان می‌دهد که حتی نمونه‌های پیچیده، مانند اسلایدهای بافتی تعبیه‌شده در پارافین با بخش‌های ضخیم و ناهموار، در کل تصویر در فوکوس باقی می‌مانند.

یکی دیگر از بخش های کلیدی مکانیسم فوکوس، موتور پیزو است که در واقع لنز یا صحنه را برای تنظیم فوکوس حرکت می دهد. موتورهای پیزو به‌جای موتورهای پله‌ای استاندارد استفاده می‌شوند زیرا سریع‌تر و دقیق‌تر هستند: آنها می‌توانند موقعیت را در نانوثانیه‌ها با دقت تا 10 نانومتر تنظیم کنند - بسیار کوچک‌تر از کوچک‌ترین جزئیات در نمونه بافت. برای اسکن با بزرگنمایی بالا (مانند 60x یا 100x، که در آسیب شناسی تحقیقاتی رایج است)، این دقت غیرقابل مذاکره است. اگر فوکوس حتی 0.5 میکرون خاموش باشد، تصویر تار خواهد شد و ساختارهای کوچکی مانند هسته یا نشانگرهای پروتئین را از دست خواهید داد. اسکنر اسلاید فلورسانس چند کاناله ما از یک سیستم موتور پیزو استفاده می کند که می تواند بیش از 1000 تنظیم فوکوس را در ثانیه انجام دهد، به این معنی که می تواند یک اسلاید فلورسانس 40 برابری را در نصف زمان یک اسکنر با موتور پله ای اسکن کند، بدون از دست دادن وضوح.

صبر کنید، اما در مورد مواردی که نمونه ها ضخیم هستند چطور؟ برخی از نمونه‌های بیولوژیکی، مانند اسلایدهای موجودات زنده یا کشت‌های سلولی سه بعدی، ده‌ها میکرون ضخامت دارند، بنابراین حتی یک لایه نمی‌تواند تمام جزئیات را ثبت کند. اینجاست که ویژگی Z-stacking اسکنرهای ما، که مستقیماً به مکانیسم فوکوس متصل می‌شود، وارد می‌شود. اسکنر به جای یک بار فوکوس کردن در هر میدان دید، 3 تا 5 عکس را در سطوح فوکوس مختلف می‌گیرد، سپس آنها را به هم می‌چسباند تا یک تصویر واحد و در فوکوس ایجاد کند که شامل هر لایه از نمونه است. برای کاربردهای تحقیقاتی، این برای مطالعه ساختار سه بعدی بافت ها یا هم محلی سازی چندین نشانگر فلورسانس ضروری است. اسکنر آسیب شناسی دیجیتال ما GScan-60 دارای حالت Z-stacking است که فوکوس را در مراحل 2 میکرونی تنظیم می کند، بنابراین هیچ جزئیاتی را در نمونه های بالینی ضخیم از دست ندهید.

من از نزدیک دیده ام که چگونه تمرکز ضعیف می تواند کار تحقیقاتی یا تشخیصی آزمایشگاه را از مسیر خارج کند. یکی از همکارانم در یک آزمایشگاه پاتولوژی کوچک یک بار به من گفت که از اسلاید اسکنر ارزان‌تری استفاده می‌کنند که تمرکز خود را روی لبه‌های اسلاید از دست می‌دهد و آسیب‌شناسان خود را مجبور می‌کنند 20 درصد تصاویر را به صورت دستی تنظیم کنند. که ساعت ها وقت را تلف کرد و منجر به تاخیر در تشخیص بیماران شد. هنگامی که آنها به اسکنرهای ما رفتند، سیستم AF ترکیبی تنظیمات دستی را به کمتر از 1٪ کاهش داد و زمان اسکن 30٪ کاهش یافت. این ارزش واقعی یک مکانیسم فوکوس خوب طراحی شده است - این فقط در مورد گرفتن یک تصویر واضح نیست. این در مورد صرفه جویی در زمان، کاهش خطای انسانی، و امکان نتایج دقیق تر است.

چند افسانه رایج در مورد فوکوس اسکنر اسلاید وجود دارد که من نیز می خواهم آنها را پاک کنم. برخی از مردم فکر می کنند که بزرگنمایی بیشتر به این معنی است که شما به سیستم فوکوس پیچیده تری نیاز دارید، اما در مورد بزرگنمایی کمتر و بیشتر مربوط به نوع نمونه است. برای مثال، یک اسلاید 40 برابری از یک نمونه بافت رنگ‌آمیزی شده نیاز به فوکوس دقیق دارد، اما یک لام 20 برابری از کشت‌های سلولی روی یک لام شیشه‌ای تخت ممکن است با فوکوس خودکار غیرفعال به خوبی کار کند. افسانه های دیگر: AF فعال همیشه کندتر از AF غیرفعال است. با موتورهای پیزو مدرن، فوکوس خودکار فعال در واقع سریع‌تر است، زیرا برای یافتن واضح‌ترین کنتراست، نیازی به اسکن چندین موقعیت نیست - مستقیماً فاصله را محاسبه می‌کند.

یکی دیگر از عوامل مهم در فوکوس کالیبراسیون است. حتی بهترین مکانیسم فوکوس اگر به طور منظم کالیبره نشود، کار نخواهد کرد. اسکنرهای ما دارای روال‌های کالیبراسیون خودکار هستند که هر بار که نوع جدیدی از اسلاید را بارگذاری می‌کنید اجرا می‌شوند، و در صورت نیاز راهنمای گام به گام برای کالیبراسیون دستی ارائه می‌کنیم. ما همچنین اسلایدهای آزمایشی را با هر اسکنر اضافه می کنیم تا آزمایشگاه ها بتوانند دقت فوکوس را تأیید کنند. برای تنظیمات تحقیقاتی، جایی که ثبات در آزمایش‌ها کلیدی است، این کالیبراسیون تضمین می‌کند که تصاویر از اسکن‌های مختلف حتی با فاصله چند ماه قابل مقایسه هستند.

اکنون، بیایید در مورد اینکه چگونه مکانیزم های تمرکز خود را برای مطابقت با نیازهای مختلف مشتریان مهندسی می کنیم، صحبت کنیم. یک آزمایشگاه تحقیقاتی که اسلایدهای فلورسانس را اسکن می‌کند، به یک سیستم فوکوس نیاز دارد که بتواند چندین فلوروفور را که می‌توانند طول موج‌های انتشار متفاوتی داشته باشند، مدیریت کند. اسکنر اسلاید فلورسانس درجه تحقیقاتی ما با سنسوری طراحی شده است که طول موج های مختلف نور را محاسبه می کند، بنابراین چه در حال اسکن کانال های DAPI (آبی)، FITC (سبز)، یا قرمز تگزاس (قرمز) باشید، فوکوس ثابت می ماند. برای آزمایشگاه‌های آسیب‌شناسی دیجیتال، که صدها اسلاید را در روز پردازش می‌کنند، سرعت بسیار مهم است—سیستم فوکوس خودکار ترکیبی GScan-60 ما می‌تواند کل اسلاید را در کمتر از 5 دقیقه اسکن کند، و مکانیزم فوکوس در هزاران اسکن از دقت کمتری نمی‌کند زیرا ما از قطعات بادوام و درجه صنعتی استفاده می‌کنیم.

همچنین مشتریانی در مورد تمرکز بر روی اسلایدهای مرطوب مانند اسلایدهای تصویربرداری سلول زنده پرسیده اند. اسکنرهای ما می توانند اسلایدهای مرطوب را کنترل کنند، اما توصیه می کنیم از حالت AF فعال استفاده کنید زیرا نمونه های مرطوب می توانند بازتاب های سطحی داشته باشند که AF غیرفعال را اشتباه می گیرد. AF فعال مبتنی بر لیزر می‌تواند به لایه مایع نازک روی اسلاید نفوذ کند تا روی خود نمونه تمرکز کند، که این یک مزیت بزرگ برای آزمایشگاه‌هایی است که تصویربرداری تایم لپس از کشت‌های سلولی انجام می‌دهند.

در پایان روز، مکانیسم تمرکز، قهرمان گمنام اسکنر اسلاید میکروسکوپ است. این بخشی است که در پشت صحنه کار می کند تا یک اسلاید شیشه ای تار را به یک تصویر دیجیتال واضح و دقیق تبدیل کند که محققان می توانند آن را تجزیه و تحلیل کنند، آسیب شناسان می توانند از آن برای تشخیص استفاده کنند، و پزشکان می توانند برای طرح های درمانی به آن تکیه کنند. چه در حال اداره یک آزمایشگاه تشخیصی کوچک، یک آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاهی، یا یک شرکت داروسازی در حال آزمایش داروهای جدید باشید، یک سیستم فوکوس قابل اعتماد لوکس نیست، بلکه یک ضرورت است.

اگر به دنبال اسکنر اسلاید میکروسکوپ هستید و می‌خواهید در مورد اینکه چگونه فناوری فوکوس ما می‌تواند با نیازهای شما مطابقت داشته باشد بیشتر بدانید، تیم ما اینجاست تا به شما کمک کند. از اسکنرهای روشنفیلد برای تشخیص معمول گرفته تا اسکنرهای فلورسانس با درجه تحقیقاتی برای تصویربرداری پیشرفته، ما می‌توانیم شما را در میان ویژگی‌هایی که برای کارتان مهم هستند راهنمایی کنیم. خواه به EScan-1200 برای آزمایشگاه آسیب شناسی خود، GScan-60 برای اسکن با توان بالا، یا اسکنرهای فلورسانس چند کاناله ما برای تحقیقات خود علاقه مند باشید، ما آماده هستیم تا در مورد اینکه چگونه تجهیزات ما می توانند گردش کار شما را ساده کرده و نتایج شما را بهبود بخشند، بحث کنیم.

مراجع

1. آگراوال، ام.، و گوپتا، آر. (2021). فناوری های فوکوس خودکار برای اسکنرهای اسلاید آسیب شناسی دیجیتال: یک تحلیل مقایسه ای مجله انفورماتیک آسیب شناسی، 12(1)، 45-52.
2. لیو، ی.، و همکاران. (2020). مکانیسم های فوکوس با دقت بالا برای سیستم های تصویربرداری کل اسلاید. معاملات IEEE در تصویربرداری پزشکی، 39 (8)، 2678-2687.
3. سازمان بهداشت جهانی. (2019). آسیب شناسی دیجیتال برای کاربردهای تشخیصی و تحقیقاتی: مشخصات فنی و بهترین روش ها. مطبوعات سازمان جهانی بهداشت، ژنو.